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酵母扩培操作要点
编辑日期:2014/11/28   作者:王平    阅读次数: 次  [ 关 闭 ]
一、实验室麦芽汁制备
(一)工艺流程
优质粉碎麦芽→温水浸提→53℃糖化50 min →63℃糖化50 min→68 ℃糖化50min至糖化完全→纱布过滤→煮沸浓缩→220目筛过滤→分装→高压灭菌→备用。
(二)操作要点
1 麦芽选择 麦芽应选择具有光泽、纯黄色、无霉变、无杂质、无病虫害、发芽均匀一致且含酶量丰富、胚乳组织疏松、细胞壁溶解良好的优质麦芽, 粉碎后的麦芽以粗粒与细粒 ( 包括细粉) 的比例为 1∶2.5 以上为好。
2 混合浸渍 粉碎麦芽与水按 1∶4 比例 37 ℃混合, 边加边搅拌。
3 三段糖化 严格控制三段糖化温度、PH值和时间(53℃糖化50 min →63℃糖化50 min→68 ℃糖化50min至糖化完全)。整个糖化过程要定时搅拌, 使各种酶充分作用, 淀粉完全分解。在淀粉酶解糖化的全过程中, 以碘液检查, 由兰色逐渐变成紫色、棕紫色、红色, 最后为无色。
4 过滤洗槽 用四层纱布过滤, 得第一麦汁, 其可溶性固形物含量 (Ts) 为 16% ~18% , 并以热水洗糟2次, 得第二麦汁, 其Ts为4%~5% , 和第三麦汁, 其 Ts一般1%~2% , 把一、二、三麦汁混合。
5 煮沸浓缩 用高压蒸汽灭菌锅在 115 ℃煮沸浓缩 15 min, 可达到破坏 A - 淀粉粉酶的活性, 稳定可发酵性糖与糊精比例, 促使蛋白质变性沉淀的目的, 最终麦汁浓度 12°。
6.过滤分装 用220目铜筛过滤除去蛋白质沉淀等物质, 然后按比例分装于适当容器中。
7高压灭菌 采用高压蒸汽灭菌。
121.5℃灭菌 20 min, 能彻底杀灭麦汁中存在的各种菌类, 特别是乳酸菌, 避免发酵时发生酸败, 以保证最终产品的质量。
二、酵母菌种分离
1.平板分离  
平板分离的目的是为了获得单一菌落。
由于菌落是由一个或少数酵母细胞繁殖而来的, 在固体基质表面而形成的肉眼可见的子细胞群体, 可起到菌株纯化的目的。平板分离常用三种方法; 即稀释倾注法、稀释涂抹法、直接平板划线法。直接平板划线法简单、快捷, 但操作者须经过专业培训和多次实践锻炼。提前制备10-12 ° 的固体麦汁培养基, 灭菌后无 菌操作倾注平板, 冷却后从活化的液体麦汁试管无菌取样, 进行平板划线分离。在直接划线法中,建议用三针划线法或四分区划线法, 培养温度同前, 培养 72-96h可获得单菌落。在固体平板上能观察菌落的大小、形态、颜色、质地、边缘隆起等现象。
接种时选择生长快, 比较大, 乳白色, 边缘整齐的正常菌落。
在分离平板中选择 4-6个单菌落,无菌操作, 接入10mL液体麦汁试管中 , 摇动至菌苔扩散, 分离, 并充分吸氧。培养温度同上, 培养时间一般为24-36h, 每4h 将试管在手掌心敲击 80-100次。 由液体试管转入 250mL 三角瓶、1L三角瓶、5L三角瓶逐级扩培。
扩培容器装量一般在55%-65% 之间, 麦汁浓度为12bP, 提前灭菌备用。培养时间在8-24h 之间, 每4h 摇动一次, 每次1-2min, 以充分吸氧, 并CO2释出。
(1)平板分离法首先把啤中国佳酒招商网酵母悬液通过一系列稀释,取一定量的稀释液与融化好的保持在42-45℃的麦汁或葡萄糖琼脂培养充分混合,然后将混合液倾注到无菌的培养皿中,待凝固之后,将平板倒置在恒温箱中25-27℃下培养2-3d。9928.TV单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落,取单个菌落制成悬液,重复上述步骤2-3次便可得到纯培养物。
(2)平板划线法 最简单的分离菌种的方法则是我们现在所说的平板划线法。用无菌的接种环取待分享培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多,常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法等。当搁环在培养基表面上向后移动时,接种环上的菌液逐渐稀释,在第三或第四划线区所划的线上可能分散着单个细胞,经过培养,每一个细胞长成一个菌落。将所需要的菌落移殖到斜面上进行培养。
(3)林德奈单细胞分享培养法将准备分享培养的酵母或发酵液移殖到已灭菌的麦汁培养基中,经过多次稀释,到每一滴麦汁仅含一个细胞。
 在无菌室中用铂金针取稀释液滴在盖玻片上,或凹型载玻片孔内,一般可以点3-5排,每一排3-5点。将盖玻片翻过来,使有小滴的一面面向凹型孔。
三、原菌试管, 液体试管活化  
原菌试管保存的菌种常用两种方法, 普通斜面试管和灌注液体石蜡的斜面试管。
普通斜面试管可在无菌操作条件下, 用接种环取1-2 环菌苔接入 10mL 液体麦汁试管中( 麦汁浓度为12 bP, 提前灭菌)活化一次。
活化 36-48h 后, 再接入 第二只液体麦汁试管, 接种量为1mL, 当接入第二只液 体麦汁试管后, 酵母菌体的生长代谢和繁殖速度明显加快, 可在培养 24-36h 后转接, 下面酵母培养温度为25 ℃ (上面酵母培养温度为27℃,)。在菌种培养活化期间, 每4小时将试管在手掌心中敲击80-100 次。
50mL麦汁三角瓶 → 20℃,48h→500mL麦汁三角瓶→ 15℃,48h→计数备用。
(每天摇动3次)
用不锈钢桶或卡氏罐再扩培一级, 如果有较大的恒温培养箱可在多个5L的三角瓶内扩培, 这一级的扩培原则是提供充足营养、无菌操作, 其他工艺条件同前。是以达到提供一定数量的优质菌种, 供发酵为目的。
种酵母接入发酵罐后, 与麦汁的比例不可大于1比10,最好在1比3-5左右。如果菌种与麦汁的比例过大, 可由二种方案解决。
第一种方案: 种酵母与麦汁严格按比例加入, 加入后通风控温培养至指数生长期, 第二次按比例添加麦汁, 通风控温培养至指数生长期, 逐次最终将罐充满后保温发酵.
第二种方案: 打入发酵罐 1/2的麦汁,接入种酵母, 接种后保温通风发酵,至进入指数生长期后, 另加入1/ 2麦汁至满灌。满罐后保温通氧发酵, 直至主发酵结束后。酵母沉降可以重复使用 7 代左右。
逐级扩培酵母所应达到的技术指标
微型啤酒的酵母扩培由于条件所限, 不同于规模化的工业生产, 扩培中更应注意无 菌操作, 通气量的大小、扩培比例, 培养时间和培养温度等诸多因素的影响。每次接种前无菌操作取样检查菌体数量、死亡率、发芽率等, 达到工艺要求后, 转入下一级培养。
评价酵母菌种优良与否, 主要从以下几个方面考虑:
1 形态学上的要求: 细胞形态为圆形或卵圆形, 优良菌株酵母短轴与长轴之比为1:(1.1-1.3) ,细胞大小趋向于中小型体积为(100um 3-160um3 ) , 相同接种量, 细胞比表面积大, 发酵速度快。
2 生理学要求: 希望选择繁殖速度快的菌株, 细胞倍增 时间短, 细胞密度增长快, 缩短接种后的停滞期, 很快进入对数生长期。
3 发酵力的要求: 主要指酵母对糖的发酵能力, 希望酵母具有良好的合成麦芽糖和麦芽三糖渗透酶的能力, 使酵母能利用麦芽糖、麦芽三糖进行发酵, 提高发酵度。
4 凝聚性和沉淀能力: 凝聚性太强的酵母 一般发酵速度较慢, 发酵度偏低, 双乙酰还原慢 。要求酵母凝聚性适中, 即能达到较高的发酵度,又沉淀坚实,发酵完毕后能顺利从发酵液中分离。
5 双乙酰峰值和还原速度: 希望双乙酰峰值低, 还原速度快。
6 挥发性风味物质: 要求酵母最终代谢产物赋予啤酒以良好的风味。
7 酵母对压力的耐受力: 希望酵母对压力有较强的耐受力。
8 酵母的稳定性: 希望酵母能抗变异, 连续发酵 10 代以上发酵速度、发酵度、双乙酰含量及酒的风格无显著变化。
9 主酵液和成品啤酒的风味品尝: 不能有特殊的 异香、异 味。
平板分离  
平板分离的目的是为了获得单一菌落。
由于菌落是由一个或少数酵母细胞繁殖而来的, 在固体基质表面而形成的肉眼可见的子细胞群体, 可起到菌株纯化的目的。平板分离常用三种方法; 即稀释倾注法、稀释涂抹法、直接平板划线法。直接平板划线法简单、快捷, 但操作者须经过专业培训和多次实践锻炼。提前制备10-12 °的固体麦汁培养基, 灭菌后无 菌操作倾注平板, 冷却后从活化的液体麦汁试管无菌取样, 进行 平板划线分离。在直接划线法中,建议用三针划线法或四分区划线法, 培养温度同前, 培养 72-96h可获得单菌落。在固体平板上能观察菌落的大小、形态、颜色、质地、边缘 隆起等现象。
接种时选择生长快, 比较大, 乳白色, 边缘整齐的正常菌落。
在分离平板中选择 4-6个单菌落,无菌操作, 接入10mL液体麦汁试管中 , 摇动至菌苔扩散, 分离, 并充分吸氧。培养温度同上, 培养时间一 般为24-36h, 每4h 将试管在手掌心敲击 80-100次。 由液体试管转入 250mL 三角瓶、1L三角瓶、5L三角瓶逐级扩培。
扩培容器装量一般在55%-65% 之间, 麦汁浓度为12bP, 提前灭菌备用。培养时间在8-24h之间, 每4h摇动一次, 每次1-2min, 以充分吸氧, 并CO2释出。
 
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